Immuno-PCR（イムノPCR）とは？ -高感度免疫検出法- BIOTIMES -バイオタイムズ-

タンパク質を検出する方法として、ウエスタンブロット（Western Blot）、フローサイトメトリー（Flow Cytometry）、酵素結合免疫アッセイ（ELISA）などが長年使用されてきました。 Immuno-PCRは、ELISAとポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を組み合わせた抗原検出方法で、高感度にターゲットタンパク質検出できます。
順を追って原理を説明します。

目次（見たい項目をクリック）

ELISA
PCR
Immuno-PCR：ELISAとPCRの組み合合わせ
ELISAからImmuno-PCRアッセイへの変換
抗体-オリゴヌクレオチド結合分子の作製
Immuno-PCRに切り替える理由
参考文献

ELISA

ELISAは、分子をマイクロプレートウェルに固定化するアッセイです。大きく分けると、ELISAには3つのタイプがあります。

1) antigen-down ELISA（直接法）
　抗原を直接マイクロプレートウェルに固相化します。
2)サンドイッチELISA
　抗原捕捉用抗体をマイクロプレートウェルに固相化し、別の抗体で検出します。
3)競合ELISA
　抗原が小さく、同時に2つの異なる抗原エピトープを持つ抗体が結合できない場合に有用です。マイクロプレートウェルに抗体を固相化し、サンプルと標識した抗原をウェルに添加します。サンプル中に抗原が多ければ、標識抗原が固相化抗体に結合できず、吸光度は低くなります。反対に、サンプル中に抗原がすくなければ、標識抗原が固相化抗体にたくさん結合でき、吸光度は高くなります。

PCR

PCRは、DNAの特定の領域を増幅するために使用される手法であり、非常に少量のDNAサンプルにも使用できます。

1）dsDNAの熱誘導変性により2つの相補鎖を分離します。
2）温度を下げてプライマーを結合させます。
3）DNAポリメラーゼを使用してターゲットDNA配列の相補的コピーを産生します。

従来のPCRでは、増幅されたDNAはゲルで泳動され、エチジウムブロマイドで染色されます。
定量PCR（qPCR）としても知られるリアルタイムPCR（Real-time PCR）は、PCR産物量を蛍光色素で経時的に測定します。感度が高く、広いダイナミックレンジを得られます。

Immuno-PCR：ELISAとPCRの組み合合わせ

抗体があればELISAでターゲットタンパク質を検出できますが、微量タンパク質を検出しようとすると、感度が足りない場合があります。一方、RT-PCRは、指数関数的にシグナルを増幅することができますが、抗体を使うわけではないため、タンパク質を直接検出することはできません。

Immuno-PCRは、「抗体-オリゴヌクレオチド結合分子」を使い、ELISAとRT-PCRを組み合わせるアッセイです。簡単に言うと、 Immuno-PCRは、ELISAの検出抗体を「抗体-オリゴヌクレオチド結合分子」に置き換えたものと考えてください。

例えば、典型的なサンドイッチELISAでは、ターゲットタンパク質に特異的な抗体がマイクロプレートウェルの表面に固相化されています。まず、マイクロプレートウェルにサンプルを添加し、固相化抗体に結合しないタンパク質を洗浄して除去します。次に、一次抗体を反応させ、サンプルに結合していない抗体を洗浄して除去します。さらに、一次抗体に対する二次抗体を反応させます。

サンドイッチELISAを免疫PCRアッセイに変換するには、標識二次抗体を「抗体-オリゴヌクレオチド結合分子」に置き換えます。RT-PCRを行うことで、オリゴヌクレオチドを増幅および検出できます。

ELISAからImmuno-PCRアッセイへの変換

Immuno-PCRの系を構築する過程は一般的なELISAと同じです。
バックグラウンドシグナルを最小限に抑えながら、ターゲットシグナルを最大化するように最適化する必要があります。プレートコーティングの方法、洗浄バッファー、ブロッキング溶液、インキュベーションの長さを検討し、バックグラウンドとシグナルを最適化していきます。なお、ELISAと同じく、 Immuno-PCR の性能は使用する抗体の性能に大きく依存します。

従来のELISAからImmuno-PCRへ置き換えられれば、高感度な検出が可能になり、サンプル中の微量タンパク質を検出できるようになります。よい系を組めれば、ピコグラム-フェムトグラムレベルのターゲットタンパク質を検出できます。